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HtPot40恒溫金屬浴在食源沙門菌DNA環(huán)介導恒溫核酸擴增法檢測

更新時間:2010-01-20   點擊次數(shù):4313次

關鍵詞】  食源沙門菌DNA環(huán) 恒溫核酸擴增法檢測

沙門菌是食源性致病菌中一個主要的屬,在各類細菌性食物中毒事件中,沙門菌造成的食物中毒位居前列〔1,2〕。常規(guī)的沙門菌檢測方法費時費力,已經(jīng)不能滿足食品生產(chǎn)質量控制的要求〔3〕。因此,需要開發(fā)一種靈敏度高并且反應迅速的方法。Notomi等開發(fā)出一種新的恒溫核酸擴增法—環(huán)介導恒溫核酸擴增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)〔4,5〕。本研究利用DNA環(huán)介導恒溫核酸擴增法對市售不同生肉來源的沙門菌進行快速檢測,并且著重在靈敏度和特異性方面對此方法進行驗證,以建立的LAMP反應條件能夠對今后病原微生物的檢測研究工作提供參考依據(jù)。

    1  材料與方法

    1.1  菌株  豬霍亂沙門菌豬霍亂亞種ATCC13312(S.ATCC13312)(廣東省微生物研究所);其余5株沙門菌HB009,HB371,HB069,HB215,HB143分別分離自市售的生豬肉、海產(chǎn)品、生牛肉、生羊肉和雞肉。其他屬菌株共14株保藏于本實驗室,作為沙門菌環(huán)介導恒溫核酸擴增反應特異性試驗中的對照菌株。所有菌株均保存在質脂雙層(LB)培養(yǎng)基中。

    1.2  儀器及試劑  HtPot40恒溫金屬?。ê戏拾旧茖W儀器有限公司);PCR擴增儀ABI2700(美國ABI公司);凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng))。Bst大片段DNA聚合酶(愛爾蘭Biolabs公司);甜菜堿(分析純,美國Sigma公司);瓊脂糖以及引物合成(大連TaKaRa生物公司)。

    1.3  方法

    1.3.1  LAMP反應引物設計  以沙門菌的屬特異性基因invA〔6,7〕為靶基因,選擇位于8 091~331之間的DNA序列作為LAMP擴增區(qū)域。將待擴增的DNA分為6個獨立的區(qū)域,根據(jù)這6個區(qū)域分別設計LAMP反應所需2對引物(內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3)。FIP由F2和F1C兩部分組成,BIP由B2和B1C兩部分組成,其2個部分都能分別識別靶DNA正義鏈和反義鏈獨立區(qū)域。外引物F3和B3分別識別靶DNA上F2和B2的外側的獨立區(qū)域,F(xiàn)3序列是5′-gcaacagctacgtgatga-3′;B3序列是5′-ctctattgccggcatcatta-3′。2對引物識別靶DNA上6個獨立區(qū)域。FIP由22個堿基F1C和20個堿基F2,以及中間連接的TTTT組成,序列是5′-cttagatccccgcattgttggttttccgccacatattatcgcgat-3′;BIP由21個堿基B1C和20個堿基B2,以及中間連接的TTTT組成,序列是5′-gaccatcatgaatggtcagcattttattggcggtatttcggtcta-3′(引物由大連寶生物公司合成)。

    1.3.2  LAMP反應  (1)DNA模板制備:DNA提取參照文獻〔8〕。(2)LAMP反應體系:25μl反應混合物包括各1.6 μmol/L的FIP和BIP,各0.2 mol/L的F3和B3,1×恒溫緩沖液,1 mol/L的甜菜堿,6 mmol/L的MgSO4,1.6 mmol/L的dNTP,8 U/μl的大片斷DNA聚合酶,1 μlDNA。(3)反應過程:除了大片斷DNA聚合酶,將其余的試劑混合物于95℃反應5 min,使DNA變性。然后迅速于冰上冷卻,并加入Bst聚合酶,將反應物混勻,置于65℃恒溫金屬浴中反應60 min,zui后在80℃條件下反應5 min結束反應。(4)LAMP產(chǎn)物檢測:肉眼觀察反應物的外觀變化并在2%瓊脂糖凝膠上100 V電泳分離25 min,加樣量7 μl/上樣孔。凝膠置于EB中染色10 min,水洗10 min,在BIO-RAD Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng)下照像檢測。

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