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從大腸桿茵中提取質(zhì)粒DNA的方法很多,其中的堿性別方法提取質(zhì)粒是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性存在差異而予以分離的。在強(qiáng)堿性條件下,染色體洲A和質(zhì)粒DNA均變性(雙鏈解開)。由于質(zhì)粒DNA是共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu),變性后兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分開。當(dāng)溶液pH調(diào)節(jié)到中性時(shí).質(zhì)粒DNA容易復(fù)性并溶解在溶液中,而染色體DNA不容易復(fù)性,互相繼繞.在利用臺(tái)式高速離心機(jī)進(jìn)行離心時(shí)極易和蛋白質(zhì)—3Ds復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)。轉(zhuǎn)移出上演液,再用乙醇沉淀出其中的質(zhì)粒DNA。具體操作步驟如下:
(1)接種一單菌落于100ml LB液體培養(yǎng)基中,加入50μl的氨芐青霉素,37℃振蕩培養(yǎng)8—10h,使培養(yǎng)達(dá)到飽和狀態(tài)。
(2)取1.5ml培養(yǎng)液利用臺(tái)式高速離心機(jī)離心20s,沉淀用100μl GTE懸浮并于室溫放置5min。
(3)加入200μl NaOH/SDS溶液,混勻,于冰上放置5min。
(4)加入150μl KAc溶液,在MixMax旋渦混合器上振蕩2s,于冰上放置5min。
(5)離心3min,然后吸取0.4ml上清液移入干凈的微量離心管中,加入0.8ml無(wú)水乙醇,室溫靜置2min。
(6)室溫下通過(guò)臺(tái)式高速離心機(jī)進(jìn)行離心3min,(使用臺(tái)式高速離心機(jī)時(shí)一定要注意轉(zhuǎn)速、時(shí)間控制以及操作規(guī)范)用lml 70%的乙醇洗滌沉淀,然后真空于燥。
(7)沉淀用30μl dd HO溶解,-20℃保存。