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關(guān)于酶切的有用知識(shí)-紅外線滅菌器技術(shù)文章
酶切是分子生物學(xué)中常用的,如何選擇酶切緩沖液,提高酶切效率,是一個(gè)十分關(guān)鍵的問題,本人摘用了其它論壇的內(nèi)容,另外將逐步整理,使酶切問題能夠比較容易解決,希望大家補(bǔ)充:
PCR產(chǎn)物的酶切。
PCR產(chǎn)物的酶切與引物上引入的保護(hù)堿基有很大的關(guān)系,所以設(shè)計(jì)引物的時(shí)候就應(yīng)該注意到這一點(diǎn),如何選擇保護(hù)堿基,具體參見NEB上關(guān)于保護(hù)堿基的資料:
2.加了保護(hù)堿基可能也會(huì)遇到切不動(dòng)的問題,切不動(dòng)可以從以下方面考慮:(1)酶切緩沖液、
每種酶都有公司提供的*緩沖液,它們的差別只是離子濃度與體系的不同,如Na、k、Mg等,還有PH值及緩沖體系(一般Tris-HCl),另外酶加甘油
和DTT作為保護(hù)劑。在雙酶切的時(shí)候常會(huì)遇到兩種酶有各自的緩沖液,要達(dá)到高酶切效率,選擇是個(gè)問題,如果酶切時(shí)間和量足夠,解決的方法:
(A)使用其中一個(gè)酶的緩沖液,但要考慮到另一酶的反應(yīng)效率,反應(yīng)效率如何,可以查查酶在不同buffer里的效率參數(shù),具體見公司,如NEB提供了很好的buffer參數(shù):
(B)
使用它們的通用的緩沖液,使兩種酶在同一緩沖液里達(dá)到也足夠的酶切效率;沒有通用的BUFFER怎么辦呢?
分兩次酶切。即先用一種酶切,膠回收后再用另一種酶切。一般先低鹽后高鹽,這種方法保證了在各自的酶切緩沖液中都得到zui大的酶切效率,但缺點(diǎn)是要回收,損
失大 ;
(C)克隆到T載體中,值得推薦的方法,克隆到T載體中,不須要考慮受這個(gè)條件的限制,酶切位點(diǎn)也可以用T載體上自帶的。
(2)酶切溫度。酶切溫度也很重要,一般的酶切zui適溫度為37度,有些特殊的酶的反應(yīng)溫度不同,如Sma Ⅰ為30度。雙酶切時(shí)這種情況下分開切,先低溫后高溫。
(3)酶切時(shí)間。酶切時(shí)間直接影響到酶切是否*,一般為1-3h,這個(gè)時(shí)間已經(jīng)足夠,對(duì)于一些活性較好的酶,30min就可以酶切*,建議在酶切1h后取5ul跑電泳以鑒定酶切效率;PCR產(chǎn)物的酶切時(shí)間較長(zhǎng),一般24小時(shí)。
(4)酶失活。如
果使用酶解凍后放置太久,可能導(dǎo)致酶失活。這種情況較少見,只能換新酶。如果拿了不同公司的酶,buffer也不一樣,怎么辦?放心,可以用不同公司的酶
進(jìn)行雙酶切,一般不會(huì)有問題的??梢韵炔椴镹EB的酶在不同緩沖液中的活性百分比,選擇它們都有適中活性的buffer,每個(gè)公司生產(chǎn)的酶反應(yīng)緩沖液針對(duì)
特定內(nèi)切酶是zui合適的!
(5)酶切體系。選用多大的酶切體系取決于你的樣品濃度,在雙酶切的時(shí)候?yàn)榱说玫劫|(zhì)量高的電泳圖,尤其插入的是小片段DNA,酶切后產(chǎn)物量較少,可以增加酶切重組DNA的量和增加上樣量,建議酶切前測(cè)定一下DNA濃度或跑電泳看看DNA有多濃,做到心中有數(shù)。